Metodología para el aislamiento de Thiobacillus sp.

Como primer paso. Se procedió al enriquecimiento de los cultivos de las bacterias quimiolitótrofas. Para ello, se inocularon 5 ml de La muestras originales en matraces erlenmeyer de 250 ml con 95ml. Las condiciones iniciales de cultivo fueron 370°C, 100 rpm de agitación y un pH inicial de 2. Estas condiciones se escogieron por ser las más utilizadas en los procesos de biolixiviación llevados a cabo en nuestro laboratorio. El medio utilizado para el enriquecimiento fue medio 9K, por las mismas razones. El medio se suplementó con distintas fuentes energéticas, principalmente hierro y azufre elemental.
Periódicamente, se extraían muestras de los cultivos y se observaban por microscopia óptica para determinar su estado, así como el número de bacterias presentes en el mismo y su morfología. Cuando se observaba un estancamiento del crecimiento bacteriano, se procedía a dar un nuevo pase al cultivo en las mismas condiciones anteriores.

El aislamiento de bacterias quimiofitótrofas presenta grandes dificultades para poder ser realizado por medios convencionales de crecimiento de colonias aisladas en placas de Petri sobre medio sólido. Estas dificultades se acentúan cuando las bacterias crecen a un pH por debajo de dos y cuando la temperatura supera los 40°C. Por estas razones,se eligió como sistema de aislamiento el método de diluciones límite para los microorganismos termófilos moderados procedentes del peñasquito

Los bancos de diluciones se repitieron 8 veces, siempre inoculando cada nueva serie a partir de la última dilución que crecía. La dilución, a partir de la que se realizaba el inóculo, se controlaba por microscopia óptica. La inoculación de una nueva serie de diluciones se realizaba en el momento en el que el cultivo con la última dilución que había crecido presentaba una densidad de población elevada. Después de 6 series de diluciones, con una duración aproximada por serie de 2 1-24 días, ya se observaba un único tipo de microorganismos presentes en los cultivos, aunque se realizaban dos pases más para asegurar el total aislamiento de la bacteria.
El resultado de estos experimentos fue la obtención de tres cultivos puros de microorganismos, capaces de crecer a tres temperaturas distintas, y a partir de los cuales se realizaron todos los experimentos posteriores de caracterización y de biolixiviación.